Utente:Dadda86/sabbionaia1

I test di mutagenesi sono analisi genetiche utilizzate per verificare la capacità di indurre mutazioni genetiche da parte di agenti fisici o chimici^[1]; sono dunque usati per indicare la genotossicità di un agente^[2]. I test possono essere compiuti su cellule, tessuti o interi organismi: nei primi due casi si parla di test di mutagenesi in vitro; nel terzo di test in vivo. La capacità di provocare mutazioni è spesso associata alla capacità di provocare cancro: per questo molti test hanno lo scopo di valutare la cancerogenicità di un agente valutandone la mutagenicità. Bisogna però precisare che non tutti i mutageni sono anche cancerogeni (così come non tutti i cancerogeni sono mutageni).

Storia e legislatura

L'azione mutageni di agenti fisici era già stata ipotizzata alla fine dell'800 e successivamente avvalorata da numerosi esperimenti su Drosophila melanogaster. In seguito gli studi del genetista Thomas Hunt Morgan mostravano probabile una capacità analoga anche da parte di agenti chimici; per questi agenti risultati importanti si ottennero negli anni '40 con i lavori di Charlotte Auerbach e colleghi. In seguito al riconoscimento di un numero crescente di sostanze mutagene e degli eventi di Hiroshima e Nagasaki si resero sempre più necessari provvedimenti per il controllo di queste sostanze. prima in stati uniti... Libro giallo...sesta Direttiva europea

Test in vitro

Con microrganismi

Le colture batteriche più utilizzate sono di organismi modello come Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae; è oggi limitato invece l'impiego di funghi come Neurospora crassa e Aspergillus nidulans. I test con batteri sono molto diffusi: i batteri infatti si replicano molto rapidamente, hanno genomi e proprietà biologiche molto conosciuti: i test sono così molto veloci ed economici. Il principale svantaggio risiede nelle differenze notevoli tra batteri e uomo ^[3]. Per questo motivo i batteri sono spesso modificati geneticamente per renderli più simili possibile a cellule umane. Tra le principali modificazioni ci sono:

l'aggiunta al terreno di coltura di S9mix, una soluzione consistente in omogeneato di fegato di ratto centrifugato a 9000 g/m con l'aggiunta di coenzimi e un tampone. La soluzione serve in quanto spesso alcune sostanze inizialmente in forma non attiva (promutageni) sono convertiti nella forma capace di provocare mutazioni da enzimi epatici; l'S9mix contiene enzimi analoghi a quelli umani e compiono questo processo di attivazione nel caso in cui la sostanza analizzata sia un promutageno.
l'uso di ceppi con mutazioni in geni che codificano per proteine che fungono da trasportatori di membrana. Le mutazioni servono per rendere le membrane più permeabili a molecole anche di grandi dimensioni: il mutageno entra così più facilmente nella cellula.
l'nattivazione di geni coinvolti nei sistemi di riparazione in modo da aumentare l'effetto dell'eventuale mutageno (aumento del tasso di mutazione).
l'inserimento nelle cellule di plasmidi con geni relitivi a sistemi di riparazione error prone (soggetti ad errore), che riparano alcune mutazioni introducendone però di altre.

Data la natura del materiale genetico dei microrganismi, i test in questione sono solitamente usati per saggiare l'induzione di mutazioni puntiformi. Nelle varie procedure, il test serve a verificare l'induzione della mutazione nell'organismo verificandone una variazione nel fenotipo. Due sono i sistemi utilizzabili:

il sistema della mutazione in avanti - in cui sono usati ceppi con fenotipo selvatico per un gene marcatore; questi vengono esposti all'agente e dopo incubazione si isolano e contano le colonie con fenotipo mutato. Il numero di colonie mutate è direttamente proporzionale alla mutagenicità dell'agente.
il sistema della reversione - il ceppo di partenza presenta già una mutazione; è noto sia il gene mutato che il tipo di mutazione presente. Si tratta il ceppo con il presunto mutageno e si verifica la presenza di colonie revertenti; anche qui più esse sono più l'agente è mutageno.

Il principale vantaggio del secondo sistema è la conoscenza della mutazione inizialmente presente nel ceppo. Nel primo sistema una mutazione di qualsiasi tipo può avere effetto; nel secondo si usano ceppi con una prima mutazione tale che solo un numero limitato di tipi di mutazioni possano dare reversione (se non addirittura un solo tipo). Con il sistema della reversione quindi si può sapere in modo diretto che tipo di mutazione è stata indotta e caratterizzare la modalità d'azione del mutageno.

I principali test che usano il sistema della reversione sono il Test di Ames e il test noto con il nome commerciale Mutatox™.

Con cellule di mammifero

Le cellule di mammifero più usate sono cellule uovo di hamster cinese o linfociti umani. Quando le cellule derivano da tessuti queste possono essere divise (per poi essere incubate in terreno di coltura liquido) con metodi meccanici o enzimatici (tramite tripsinizzazione ad esempio). Possono essere utilizzate cellule direttamente prelevate da tessuto vivo e formare così colture cellulari primarie, caratterizzate però da un numero limitato di divisioni cellulari prima della degenerazione; oppure linee cellulari ignegnerizzate in modo da poter compiere un numero elevato di divisioni (colture cellulari immortalizzate). I vantaggi sono l'avere a disposizioni sistemi biologici uguali (o molto simili) a quelli umani, quindi simulare in modo molto vicino alla realtà l'azione che avrebbero gli agenti sull'uomo.

Test in metafase

Per questa tecnica, dopo essere state esposte al potenziale mutageno, le cellule sono sincronizzate e bloccate in metafase (tramite colchicina); in seguito a procedure di fissaggio le cellule vengono poi lisate delicatamente e da esse viene prelevato il materiale genetico. I cromosomi isolati vengono poi "colorati" per visualizzarne eventuali alterazioni. Non dando informazioni sulla sequenza nucleotidica questa tecnica è utile a investigare solo la presenza di mutazione su larga scala. La tecnica più semplice consiste nel trattare i cromosomi con sostanze che li colorano in modo omogeneo (come ad esempio l'orceina o il DAPI): in questo modo si può facilmente osservare la presenza di cromosomi in eccesso o in difetto (e quindi l'induzione da parte del mutageno di mutazioni genomiche).

Bandeggiamento

Con questo metoco i cromosomi invece di essere colorati uniformemente presentano ciascuno particolari schemi di bande; i cromosomi possono così essere distinti e riconosciuti facilmente

FISH

Test in interfase

Test in vivo

Note

^ La gran parte dei test è comunque compiuto con agenti chimici, ovvero molecole e composti, soprattutto vista la loro diffusione e la frequenza con cui vi entriamo in contatto.
^ I termini genotossico e mutageno sono sostanzialmente sinonimi.
^ i test vogliono, ovviamente, dimostrare la pericolosità di un mutageno per l'uomo e sono quindi tanto più utili quanto più il sistema biologico su cui sono applicati mima quello umano

Bibliografia

(IT) Lucia Migliore, Mutagenesi ambientale, Bologna, Zanichelli, 2004. ISBN 8808-07719-5

Mutazioni
Mutazioni geniche
Mutazioni punitformi - Mutazioni di sequenze ripetute
Mutazioni cromosomiche
Inversione - Delezione - Duplicazione - Traslocazione
Mutazioni genomiche
Euploidia aberrante: Monoploidia - Poliploidia
Aneuploidia: Trisomia - Monosomia - Nullisomia - Disomia
Mutazioni per traslocazione
Malattie genetiche

[1] La gran parte dei test è comunque compiuto con agenti chimici, ovvero molecole e composti, soprattutto vista la loro diffusione e la frequenza con cui vi entriamo in contatto.

[2] I termini genotossico e mutageno sono sostanzialmente sinonimi.

[3] test vogliono, ovviamente, dimostrare la pericolosità di un mutageno per l'uomo e sono quindi tanto più utili quanto più il sistema biologico su cui sono applicati mima quello umano

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